Nature Plants volume 9、pages 128–141 (2023)この記事を引用
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細菌はエフェクタータンパク質を宿主細胞に注入して、疾患を促進する細胞プロセスを操作します。 細菌は微量のエフェクターを標的の宿主細胞にのみ送達するため、大量感染した宿主組織からエフェクター依存性の細胞変化を捕捉することは技術的に困難です。 今回我々は、特定の細胞型でタグ付けされた核のエフェクター誘導性単離（eINTACT）と呼ばれる新しい技術を報告する。この技術は、ザントモナス細菌エフェクターを受容したシロイヌナズナ植物細胞からの核のアフィニティーベースの精製を容易にする。 精製された核の分析により、キサントモナス属のエフェクター XopD がシロイヌナズナのアブシジン酸シグナル伝達関連遺伝子の発現を操作し、浸透圧ストレスに応答した気孔閉鎖に必要なカルシウム透過性チャネルをコードする遺伝子である OSCA1.1 を活性化することが明らかになった。 OSCA1.1 の喪失は葉の萎凋と感染した葉の細菌増殖の減少を引き起こし、OSCA1.1 が宿主の感受性を促進することを示唆しています。 eINTACTにより、XopDが宿主のOSCA1.1/アブシジン酸浸透圧シグナル伝達媒介気孔閉鎖を利用して、細菌の増殖に有利な湿った生息環境を作り出し、天然の多数のグラム陰性植物細菌のエフェクターの機能を正確に解明するための新たな道が開かれることが明らかになった。感染状況。
細菌性病原体は、自然の開口部 (気孔や胞状腺など) または傷口を介して宿主植物に侵入し、その後細胞間のアポプラスト空間または道管内で増殖します 1,2。 感染を促進するために、毒性のグラム陰性細菌は、注射器のような多タンパク質複合体である III 型分泌システム (T3SS)3 を使用して宿主細胞にエフェクターを注入します。 宿主細胞内では、エフェクターは特定の細胞内コンパートメントに局在し、宿主の細胞プロセスを操作して宿主の免疫を抑制したり、細菌の増殖や拡散に有利な環境を作り出したりします4,5。 細菌性病原体に関する最近の研究では、植物における水性アポプラスト空間の確立が細菌の毒性にとって重要であることが示唆されています6。 実際、Pseudomonas syringae HopM16、Xanthomonas gardneri AvrHah17、Xanthomonas translucens Tal88など、感染組織内の水分量の増加を引き起こすことにより疾患を促進するいくつかのエフェクターが同定されています。 系統発生的に異なる細菌属におけるエフェクターの多様性のため、エフェクターを介した植物の感受性の根底にある分子機構は依然として謎が多い。
ザントモナス・カンペストリス pv. カンペストリス 8004 株 (Xcc8004) は、多くのアブラナ属作物およびモデル植物シロイヌナズナに黒腐病を引き起こす葉維管束病原体です2。 そのエフェクタータンパク質の 1 つであるキサントモナス アウター プロテイン D (XopDXcc8004、この研究では XopD) は、3 つの N 末端植物特異的エチレン応答性エレメント結合因子関連両親媒性抑制 (EAR) を含む核局在型 III 型エフェクター タンパク質です。通常、植物の転写サイレンシングを媒介するモチーフとC末端システインプロテアーゼドメイン9（拡張データ図1）。 興味深いことに、以前の 2 つの研究では、シロイヌナズナにおける XopD の異なる活性が報告されています 10,11。 ある研究では、XopD は初期の葉壊死を抑制することで病気を促進するが、感染したシロイヌナズナの葉における細菌の増殖には影響を及ぼさないことが示されました 10。 XopD は、EAR モチーフを含むドメインを介して、ジベレリン酸 (GA) 応答性遺伝子の主要な転写抑制因子であるシロイヌナズナ DELLA タンパク質と相互作用し、安定化します 10。 しかし、XopD と DELLA の相互作用は、GA 応答性転写物のレベルに検出可能な変化を引き起こしません 10。 物議を醸しているが、別の研究では、シロイヌナズナにおけるβ-エストラジオール誘導性プロモーターの制御下でのXopDのトランスジェニック発現がサリチル酸（SA）依存性の防御反応を引き起こし、細菌の増殖を抑制したため、XopDの無毒性効果が推測された11。 さらに、XopD は小型ユビキチン様修飾因子 (SUMO) プロテアーゼ活性を有しており、フィトクロムシグナル伝達に関与する転写因子 (TF) であるシロイヌナズナ HFR1 と相互作用し、脱 SUMO 化することが in vitro で判明しています 11。 両方の以前の研究を総合すると、XopD が植物 TF および宿主植物ホルモンシグナル伝達経路の活性を調節できる可能性があることを示唆しています。 それにもかかわらず、XopD の正確なイン プランタ機能の基礎となる分子機構はまだ決定的なものではありません。
2) enriched biological GO terms. The DEGs that were not annotated by these GO terms were not shown. c, WashU Epigenome Browser snapshots showing mCG and mCHH methylation levels at SUVH9 and OSCA1.1 loci. Positive and negative bars indicate 5-methylcytosine levels of single cytosine on the Watson (+1) and Crick (−1) strands, respectively. The transposable elements (TEs) are shown as grey boxes. The transcription start site (TSS) is indicated with a brown triangle. d,e, The expression levels (mean read counts) of OSCA1.1 (d) and PR1, PR2, PR5, EDS1 and PAD4 (e) in nuc−XopD and nuc+XopD. Data are presented as mean values ± s.e.m. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. DESeq2 P values are from Wald test corrected for multiple testing using the Benjamini–Hochberg method (nuc−XopD versus nuc+XopD; OSCA1.1, P = 0.033; PR1, P = 0.819; PR2, P = 0.947; PR5, P = 0.794; EDS1, P = 0.833; PAD4, P = 0.981). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). f, Relative expression of XopD, PR1, PR2, OSCA1.1 and HYL1 after XopD was induced by β-estradiol in Arabidopsis seedlings, relative to their expression in DMSO-treated seedlings. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.e.d. (error bars) from n = 2 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (DMSO-treated seedlings versus β-estradiol-treated seedlings; XopD, P = 0.04; PR1, P = 0.04; PR2, P = 0.03; OSCA1.1, P = 0.42; HYL1, P = 0.15). *P < 0.05; NS, not significant (P > 0.05). Small circles indicate data points of individual biological replicates (d–f)./p> 0.05). b, RT-qPCR analysis of RD29A expression in nuc+XopD relative to its expression in nuc−XopD. The expression of TUB2 is used as a control. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (P = 0.043). *P < 0.05. c, Relative abundances of miR159a in nuc−XopD and nuc+XopD compared to its abundance in total nuclei of mock-inoculated leaves. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 3 independent biological replicates and normalized against the abundances of ACTIN2/8 in each sample. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (nuc−XopD versus nuc+XopD, P = 0.019). *P < 0.05. d, Representative leaves infected with indicated bacterial strains under regular (60%) or high (95%) humidity conditions at seven DPI. Mock, treatment with buffer; ABA, treatment with ABA. e, The water loss rate of detached Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) infected leaves at seven DPI. Data are presented as mean values ± s.d. (error bars) from n = 8 leaves from four different plants. f, A boxplot representing bacterial population density in symptomatic leaf tissues inoculated with Xcc* (+XopD) and Xcc∆xopD* (−XopD) at seven DPI. Horizontal lines from the top show maxima, upper quartile, median, lower quartile and minima values, and cross marks show the mean values. For each treatment, n = 8 leaves from four different plants were examined. Statistical significance is determined by a two-sided unpaired t-test (no treatment: Xcc∆xopD* inoculated leaves versus Xcc* inoculated leaves, P = 0.046; Xcc∆xopD* inoculated leaves: mock treatment versus ABA treatment, P = 0.014). *P < 0.05. Small circles (a–c,f) represent data points of individual biological replicates./p>six-fold) lower in nuc+XopD (Fig. 4c), which coincided with a significant increase in MYB33 expression in these nuclei (Fig. 4a)./p> 5, false discovery rate (FDR) adjusted P value < 0.05, |log2FC| > 1)47./p>96% methylated pUC19 DNA spiked in) was sheared to 100–500-bp fragments using a focused ultrasonicator (Covaris E220 system), in microtubes at a setting of 175 peak incident power, 10 dc, 200 cpb for 40 s. Enzymatic methyl-sequencing (EM-seq) libraries were prepared from sheared DNA using NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit following the manufacturer instructions (New England BioLabs). Due to the amount of starting DNA material being lower than 10 ng, the minimum recommended amount of starting material by the manufacturer, we added two PCR cycles at the final step of PCR amplification of the sequencing libraries. Libraries were sequenced on NovaSeq 6000 system (Novogene) for collecting 2× 150-bp paired-end reads that passed the Illumina quality control filter (Supplementary Table 8)./p>100 bp, mean methylation difference >0.15, test statistic areaStat >10. A locally installed WashU Epigenome Browser was used for visualizing DNA methylation at single-base resolution54./p>2) sample types were analysed by ANOVA followed by post hoc Tukey’s honestly significant difference. Experiments were performed at least twice with similar results./p> 0.05)./p> 0.05)./p> 0.05)./p> 0.05)./p>
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