新鮮な無傷のシロイヌナズナ葉のデンプン含有量の非破壊概日プロファイリング

Scientific Reports volume 12、記事番号: 16525 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

植物の葉緑体は光合成を行って太陽エネルギーを、日中の細胞の生存と成長に不可欠な炭素源となる糖に変換します。 光合成産物の一部はデンプン顆粒を形成することによって葉緑体に蓄えられ、夜間に炭素エネルギーを供給し続けます。 現在、デンプンの時間的パターンをプロファイリングするには、(i) 葉を犠牲にするか、(ii) 遺伝子組み換え顆粒結合デンプンシンターゼ (GBSS) を組み込むことによって代謝を変化させるリスクを冒してトランスジェニック植物を生成するかのいずれかが必要です。 この論文では、二光子蛍光 (TPF) と第二高調波発生 (SHG) イメージングを使用して、昼夜サイクルにわたって新鮮な無傷の葉の葉緑体内のデンプン粒を定量する非破壊的方法を実証しました。 これを、正常および過剰のデンプン含量を有する２つのシロイヌナズナ系統、すなわち野生型（Columbia-0）およびデンプン過剰１（sex1）を使用して行った。 デンプン顆粒はSHGイメージングによって可視化され、一方、葉肉細胞内の葉緑体はTPFイメージングによって可視化されました。 私たちの結果は、葉内のデンプン分布のミクロンスケールの空間分解能を提供し、以前の研究で酵素アッセイによってプロファイルされたものと一致するデンプンの概日パターンを示しました。 我々は、TPF-SHGイメージングが、破壊的なサンプル前処理を必要とせずに、葉の細胞におけるデンプンの概日リズムの不均一性をリアルタイムで明らかにするための潜在的なツールであることを実証しました。

デンプンは高等植物における炭水化物の主な貯蔵庫です1。 植物でデンプンが生成される場所は主に 2 つあります。 1つは光合成が行われる葉の中にあります。 もう1つは茎や根などの貯蔵器官にあります。 貯蔵器官内のデンプンは継続的に蓄積され、成長に必要になるまで分解されません。 しかし、葉に含まれるデンプンには日内変動があります。 日中、光合成によりデンプンが生成され、葉緑体に蓄積されてデンプン顆粒が形成されます2,3。 夜間に光合成が停止すると、細胞の生存と成長に必要なエネルギーは、日中に葉に蓄えられたデンプンの分解によって供給されます4、5、6。 即時デンプンの変化を監視する能力は、デンプンの代謝に関与するディール機構を追跡するために重要です。

デンプンの定量に一般的に使用される方法には、酵素法 7,8、デンプンヨウ素染色、および遺伝子組み換えが含まれます。 酵素法は、酵素でデンプンを抽出および分解し、デンプンに貯蔵されているグルコース残基の総量を定量するために使用できます9。 ヨウ素溶液染色法は、葉からデンプンを抽出せずにヨウ素を使用して染色します。 しかし、染色されたでんぷんをはっきりと観察するには、糖とクロロフィルをアルコールで溶解して除去する必要があります。 この方法では、組織内のデンプンの位置と分布を決定できますが、クロロフィルの溶解とヨウ素溶液による染色が必要なため、準備の過程で葉を破壊してしまいます。 デンプンを測定するもう 1 つの方法は、目的の標的遺伝子を含む構築物をクローニングし、ゲノムにランダムに組み込まれた構築物を保持するトランスジェニック植物を取得することです。 デンプンの代謝に関与する酵素を使用し、それを蛍光タンパク質に融合させると、蛍光イメージングによるデンプンの観察を可能にするトランスジェニック植物が得られます10,11。 デンプンの定量分析に蛍光タンパク質イメージングを利用してもトランスジェニック葉は破壊されませんが、トランスジェニック植物の作製は複雑で時間がかかり、対象となる生態型ごとに行う必要があります。 植物のデンプンを定量するために使用されてきたもう 1 つの非破壊的方法は、マイクロ CT イメージングであり、これは特に木本茎の条線および軸実質 (RAP) に適用されました 12。 この最後の方法はデンプンからの独特のコントラストを提供しないため、画像解析からの RAP 細胞の形状とサイズの使用に依存しており、デンプンの測定一般に簡単に適用することはできません。