Communications Biology volume 6、記事番号: 646 (2023) この記事を引用
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病気を媒介する蚊であるヒトスジシマカおよびネッタイシマカの化学的防除は、費用がかかり、持続不可能であり、殺虫剤耐性の蔓延により効果がますます低下しています。 無菌昆虫法は貴重な代替手段ですが、時間がかかり、エラーが発生しやすく、無駄が多い雌雄分離方法によって制限されます。 ここでは、トランスジェニック雄の単離を可能にする、m および M 性座位に関連付けられた蛍光マーカーに基づいた 4 つの遺伝的性分け系統 (ヤブカ属の種ごとに 2 つ) を紹介します。 さらに、これらの性判別系統を組み合わせることで、非トランスジェニック雄の作出がどのように可能になるかを実証します。 大量飼育施設では、1 台の機械で推定 0.01 ～ 0.1% の雌の汚染を伴う 100,000 匹の 1 齢雄幼虫を 1.5 時間以内に選別できました。 費用効率の分析により、これらの菌株を使用すると、大量飼育施設の設置と運営に際し、大幅な節約につながる可能性があることが明らかになりました。 まとめると、これらの遺伝的性別決定株により、これらの重要なベクターに対する制御プログラムの大幅なスケールアップが可能になるはずです。
ネッタイシマカとヒトスジシマカは、デング熱 (DENV)、チクングニア熱 (CHIKV)、ジカ熱 (ZIKV)、黄熱病 (YFV) ウイルスを含む多くの病原体の伝播の原因となる侵入性蚊種です1、2。 気候変動と世界貿易により、両方の媒介ウイルスが急速に蔓延しており、効果的な制御策がなければ、2050 年までに世界人口の 49% がヤブカ属伝染病のリスクにさらされると予測されています 3,4。
遺伝子制御を使用した蚊の個体数の抑制は、殺虫剤の使用に代わる最も効果的で持続可能で環境に優しい代替手段の 1 つです。 これは、無菌状態（Serile Insect Technique、SIT5 および pgSIT6 を含むその派生型）、ボルバキア感染型（Incompatibility Insect Technique、IIT7、8、9）、またはその両方 10、11、または致死性導入遺伝子を保有する（優性致死性を保有する昆虫の解放、RIDL）12。 これらすべての介入には、効率的な性分離方法が必要です。 現在、ネッタイシマカの性別は、完全に手動 13,14 または部分的に自動化されている 11 のホック選別機を使用して、自然の蛹サイズ二型に基づいて判定されています。 この方法は、均一な蛹サイズ、したがって密度が最適化された幼虫飼育条件を必要とするが、雌の汚染率が 0.8 ～ 1% であり、日次およびユーザー間の変動が大きいという問題がある 15。 特に、1.13 × 10−7%の雌の汚染を許容する多段階の蛹と成体の選別機が最近報告されました9。 しかし、このシステムは、他のすべての既存の方法と同様に、後期段階で選別し、飼育された雄の半分未満しか回収できないという欠点を共有しており 14、これは、総さなぎの > 75% が無駄に飼育および給餌されることを意味します。
ハマダラカでは、若い幼虫の自動性分離を可能にするトランスジェニック遺伝性雌株 (GSS) が記載されています 16、17、18、19。 蛍光マーカーは、男性特異的な調節配列を使用するか、マーカーを Y 染色体に結合することにより、男性特異的な発現を示します。 ハマダラカ属コルッツィの雌雄決定株の 1 つは X 連鎖であり 20、雌の方が雄よりも蛍光性が高くなります。 性の分離は、複雑なオブジェクト パラメトリック アナライザーおよびソーター (COPAS) デバイスを使用して行われます。このデバイスはフローサイトメーターとして機能し、蛍光に従って大きな粒子を分類します。 さらに、トランスジェニック雄の放出の代替として、COPAS を使用して非トランスジェニック雄のみの集団を生成する交雑スキームが提案されました 21。 このスキームでは、Y 染色体上に蛍光マーカーを保持する株と、X 染色体上に蛍光マーカーを保持する別の株が必要です。 最初の系統の非トランスジェニック (X-/X-) メスと 2 番目の系統のトランスジェニック (X+/Y-) オスを交配すると、トランスジェニック (X+/X-) メスと非トランスジェニック (X-/Y) からなる子孫が得られます。 −）男性。
120 piggyBac random insertions (Fig. 1d). The best m-linked insertion line that we obtained showed a recombination frequency of 0.1%. Its transgenic cassette harboured a Cas9 transgene associated with a DsRed fluorescence marker and was flanked by lox sites. A Cas9 transgene being undesirable in a sexing strain, we excised it using CRE recombinase and replaced it with an eGFP transgene. This Ae. albopictus m-linked strain was termed Aal-m. Sequencing of the transposon’s flanking genomic sequence indicated that it had landed into a highly repeated region; hence, its exact genomic location could not be identified but matched several loci in 1q31 (see Methods and Supplementary Data 1). Both Ae. albopictus transgenic lines show a clear sex-separation pattern in COPAS analyses (Fig. 1c, d). All four lines were fluorescence-sorted and screened at each generation. In the Aaeg-M line, a single recombination event was visually recorded after 15 generations (>10,000 individuals screened in total). Consequently, we estimated that the Aaeg-M and Aaeg-m lines recombine at approximately 0.01%. In Aal-M, four recombinant individuals were observed in the tenth generation after successively screening a total of >50,000 individuals. These recombinations are likely to have arisen from a single event, suggesting that recombination is extremely rare in the Aal-M strain as well./p>$50,000 savings at 20 M males/week and above, Fig. 5e). In total, considering construction, equipment, diet and consumable costs, GSS is predicted to be the most economical option at all tested throughputs, while GSS-CS starts to be more economical compared to manual sorting of pupae from a 10 M males/week throughput (Fig. 5f). Moreover, the workload, the cost of which can only be estimated on a country-by-country basis, is reduced by 29–38% with GSS and 18–27% with GSS-CS (Fig. 5g). For all comparisons, including equipment cost, the most expensive option is the automated sorting of pupae, as the devices are expensive (e.g. $40k for the automated sorter from11, J. Bouyer) and the number of insects to be reared is high (Fig. 5b–g)./p>20,000 screened larvae), we later injected the repair donor plasmid (190 ng/µL) with 5 µM Scr7 and three plasmids expressing different gRNAs under the control of different AeU6 promoters (70 ng/µL each plasmid). This method gave significantly higher knock-in rates (25 GFP positive larvae out of about 4000 screened)./p>20,000 G1 larvae screened, a single transgenic male larva was found, raised to adulthood, and crossed to WT females. Its progeny was composed of 100% eGFP positive sons and 100% eGFP negative daughters, indicative of M linkage. We termed this Ae. aegypti M-linked strain Aaeg-M. Upon injection of 600 BgR9 eggs with the pX3 repair plasmid and a mixture of three plasmids expressing gRNAs (GTGGCATAGCGCCGTGTGGA[GGG], GTCTTAAATGAAAGAGGCG[AGG], GTATCATGCGTATTGCGAG[AGG], brackets indicate the PAM) under the control of three different U6 promoters (gRNA cloning vectors: Supplementary Data 4), 43 larvae with transient eGFP expression were recovered in G0. Resulting 20 males and 20 females were crossed en masse to adults of the opposite sex. 25 transgenic G1 larvae were obtained, 10 of which were males carrying an M-linked insertion, 4 were males carrying an m-linked insertion and 11 were females carrying an m-linked insertion. Proper insertion site in AAEL019619 was confirmed by PCR in all tested individuals, which revealed that in some of these mosquitoes the whole repair plasmid had integrated. From a single male devoid of the plasmid backbone, an Ae. aegypti m-linked strain named Aaeg-m was established and further characterized. Both Aaeg-M and Aaeg-m lines were backcrossed into a Brazilian (Bra) genetic background for 7 generations./p>700 individuals screened in each line until the sixth generation (Supplementary Table 3). Most other M-linked lines also showed 100% fluorescent males but contained additional, non-M-linked multiple insertions and were discarded. Based on line fitness and COPAS profiles, we selected a YFP line termed Aal-M for further work as an Ae. albopictus M-linked strain. Additional M-linked lines marked with OpIE2-GFP or Pub-DsRed showing no recombination to date, carrying a docking attP site for subsequent transgenesis, and representing additional GSSs are also being maintained to date but were not further characterized in detail./p>120 random piggyBac insertions. For this, we screened our existing collection of Ae. albopictus transgenic lines for m/M-linkage and constructed an additional library of piggyBac constructs expressing various fluorescence proteins (eGFP, mTurquoise2, YFP or DsRed) under the control of promoters showing distinct expression patterns (3xP3, OpIE2, Ae. aegypti PUb, Drosophila melanogaster actin5C). By performing multiplex injections of these piggyBac plasmids together, we obtained lines carrying up to six distinct insertions as indicated by their colours and patterns of fluorescence. Out of 40 independent founder transgenic individuals screened (most of which carrying multiple insertions), only two insertions appeared m-linked: one carried an OpIE2-mTurquoise2 marker gene with a recombination rate of about 3%, and the other, called m-albR9, carried a Cas9 transgene with a DsRed reporter gene and showed a recombination rate of 0.1%. We exploited the latter, in which transgenes are flanked by two lox sites adjacent to an attP docking site. We injected m-albR9 eggs with a plasmid encoding Cre recombinase to excise Cas9 and DsRed transgenes, as Cas9 is undesirable in a GSS. From successfully excised individuals, we established an m-linked attP docking line, mX1, carrying no further transgene. In a second step, an attB-containing plasmid carrying a PUb-eGFP marker cassette was integrated into the attP site. The m-linkage of this new strain was verified by crossing eGFP males to WT females and screening their offspring. The new Ae. albopictus m-linked line, named Aal-m was made hemi/homozygous and amplified./p>
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